淺談PCR反應體系構建設計中的重要要素--引物

　　PCR具有突出的優勢，如特異性，靈敏度，高產率，快速，簡便，可重復性好，易于自動化。它可以在試管中分析待研究的靶基因，或者可以在幾個小時內將某個基因片段擴增到十萬甚至一百萬次，使肉眼可以直接觀察判斷。從頭發，一滴血甚至是細胞中提取的DNA都可以擴增出足夠數量的DNA用于分析研究和測試鑒定。PCR技術是生物醫學領域的一項舉措和里程碑。因此，PCR反應體系構建是非常必要的。

　　PCR反應的五個要素：參與PCR反應的五種主要物質，即引物，酶，dNTP，模板和Mg2+。引物是在PCR反應體系構建特定反應的關鍵。PCR產物的特異性取決于引物和模板DNA之間的互補程度。從理論上講，只要您知道任何模板DNA序列，就可以設計一條互補的寡核苷酸鏈作為引物，并使用PCR在體外擴增模板DNA。
 

　　PCR反應體系構建設計中引物應遵循什么原則？

　　1、引物長度：15-30bp，通常在20bp左右；

　　2、引物擴增范圍：200-500bp為宜，具體條件可擴增大10kb的片段；

　　3、引物堿基：40％-60％的G+C含量合適，G+C太少，擴增效果差，G+C太容易出現非特異性條帶。ATGC是隨機分布的，避免了5種以上的電子核苷酸嘯叫或字符串排列；

　　4、避免引物的二級結構，避免兩個引物之間的互補，尤其是3'末端互補，否則會形成引物二聚體以產生非特異性擴增條帶；

　　5、引物3'末端的堿基，尤其是后一個和倒數第二個堿基，應嚴格配對，以避免末端堿基的堿基錯配導致PCR失敗。

　　6、引物具有或可以加入合適的限制位點。擴增的靶序列應具有合適的限制位點。這適合進行限制性分析或分子克隆非常有益；

　　7、引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫中的其他序列沒有明顯的同源性。